技术平台-安沛治療有限公司

在适配子创新药物技术平台研发方面，公司目前聚焦如下三大技术环节-适配子药物发现、适配子药物长效设计的修饰、适配子药物高亲和性设计的修饰。

如何高效筛选获得高亲和性的适配子、如何延长适配子的消除半衰期、如何提高适配子与蛋白分子靶点的亲和力，是适配子药物的三个最主要的成药性技术环节（图1和图2）。适配子的高效筛选策略是适配子药物发现的基本科学范畴（Yu et al., Int J Mol Sci 2016; Chen et al., Int J Mol Sci 2021），而适配子的长效设计的修饰策略、适配子与蛋白分子靶点的高亲和性设计的修饰策略是适配子药物设计的两个基本科学范畴（Ni et al., ACS Appl Mater Interfaces 2020; Yu et al., Acta Pharm Sin B 2022）。公司经过不断的技术积累，分別发展了如下高效的药物发现技术、长效修饰的专利技术和高亲和修饰的专利技术。

适配子药物发现技术：公司在高亲和性适配子序列的筛选上采用了实验生成与人工智能算法预测相辅相成的策略。核酸适配子的筛选是通过SELEX技术从起始随机文库（～10¹⁵条单链寡核苷酸序列）筛选获得富集文库，然后通过高通量测序获得富集文库中的候选序列信息（～30万条单链寡核苷酸序列）。但实验方法不可能完成所有候选序列的亲和力表征，因此需要挑选有限的代表性序列进行测定。这种挑选方法具有很大的局限性，往往会遗漏有高亲和力潜力的优质序列，这也是导致核酸适配子筛选高失败率的原因之一。基于人工智能算法对候选序列信息的预测能够克服人工挑选候选序列的局限性。通过人工智能算法构建出整个序列空间（图3），算法模型通过向已获得的海量SELEX数据学习高亲和性适配子的特征，进而能够判别和生成新的具有潜在高亲和性的适配子序列，从而大幅缩小下一步核酸适配子合成实验的验证范围，减少了时间成本和经济成本，提高了筛选效率。Aptacure经过先后开发的三代筛选技术的迭代，特别是基于人工智能技术的应用以后，对SELEX筛选后得到的富集文库的序列分析深度显著升高，获得高亲和力表征的候选适配子序列数显著增多（图4）。

适配子药物长效设计的修饰技术：核酸药物通常可通过PEG修饰（聚乙二醇修饰剂）来增加药物的分子量达到并超过肾脏阈值（30–50 kDa）以延长其在体内的消除半衰期。这种修饰策略会导致药物整体中适配子的含量（占比）很低，特别是在注射体积固定的场景下（譬如皮下注射），单次注射的实际的适配子剂量偏低，一方面限制了剂量提高，导致影响治疗效果，另一方面由于需要反复注射，导致影响治疗依从性。人血清白蛋白的分子量为67 kDa，约占血浆总蛋白量的60%，该蛋白具有疏水大空腔，某些特殊的小分子化合物可以插入白蛋白不同的结构域腔体通过非共价的形式与之结合形成分子复合体，在策略上，可以用这些小分子化合物去修饰适配子，从而带着适配子去与血清白蛋白结合，形成适配子-小分子-血清白蛋白的分子复合体，变相增加了适配子的分子量，达到并超越肾脏阈值，从而延长了自身在体内的消除半衰期（Zhang et al., Front Cell Dev Biol 2022）。公司前期先后筛选出与血清白蛋白具有高亲和力的两个结构类别不同的小分子化合物，将它们先后修饰到适配子上形成相应的偶合物（图5）。经动物实验验证，硬骨抑素适配子先后经过单分子修饰和双分子修饰以后，特别是双分子修饰的硬骨抑素适配子在大鼠体内的消除半衰期可从单分子修饰可以达到的8天进一步延长至12天（专利申请号：PCT/CN2022/082996），而原先PEG修饰的硬骨抑素适配子以及已上市的硬骨抑素单抗在大鼠体内的半衰期也都仅为3天，提示经过长效修饰的适配子在啮齿类动物的半衰期，可以达到对应同一靶点的PEG修饰的适配子和对应同一靶点的上市单抗（Florio et al., Nat Commun 2016）的半衰期的4倍。公司经过先后开发的四代长效修饰技术在延长硬骨抑素适配子体内消除半衰期的作用越来越突出（图6）。这一长效修饰技术迭代，一方面可以大大提高适配子含量在药物整体中的占比（图7），显著提高适配子药物的单位剂量的治疗效应，另一方面可以显著提高适配子药物的治疗依从性。公司开发的第二代单分子修饰的硬骨抑素适配子与PEG修饰的硬骨抑素适配子，在相同的给药剂量（25 mg/kg）和短给药间隔（三天），对比治疗以后在卵巢切除大鼠骨三维结构上的差异，发现两种修饰的硬骨抑素适配子都能增加骨量和改善骨结构，第二代单分子修饰的硬骨抑素适配子比PEG修饰的硬骨抑素适配子的治疗效果更有优势（图8），这体现适配子修饰后的长半衰期和适配子在药物中的高占比两者共同对治疗活性的贡献。基于双分子修饰为主要特征的第四代长效修饰技术中，两种小分子的衍生物种类繁多，如果人工合成所有的衍生物以及对不同的组合进行验证，在人力成本、物力成本、时间成本上都是一个极大的挑战。目前，公司正利用自己建立的DNA芯片技术快速获取大量衍生物与靶蛋白结合的亲和力数据来构建并训练人工智能生成及组合优化模型，从而加快第五代长效修饰策略的研发进程（图9）。

适配子药物高亲和性设计的修饰技术：天然的DNA适配子仅由4种脱氧核糖核苷（A/G/C/T）构成，化学多样性远不如20种氨基酸构成的抗体。因此，指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的天然DNA适配子与蛋白分子靶点的亲和性仍然存在可以改善的空间。疏水作用在蛋白质的折叠、药物分子与受体的相互作用中扮演着重要的角色。由于DNA/RNA聚合酶耐受脱氧尿苷C5（dU-C5）位化学修饰，在策略上，可以用疏水分子去修饰适配子的dU-C5形成相应的修饰物，从而显著提高适配子对蛋白靶点的亲和力。公司前期筛选出与靶蛋白具有高亲和力的修饰dU-C5的疏水分子，将它们应用到pre-SELEX阶段后，可以筛选获得具有高亲和力的适配子；为进一步模拟抗体-抗原之间的高亲和力、高特异性相互作用，公司在post-SELEX阶段直接赋予适配子氨基酸侧链，并保留了适配子碱基完整的化学结构（图10）；从pre-SELEX到post-SELEX，公司经过先后开发的三代亲和性修饰技术经过迭代在提高硬骨抑素适配子对骨硬化素蛋白的亲和力上越来越显著，其亲和性几乎是同靶点单抗的10倍（图11）。相关适配子高亲和修饰技术已经提交专利申请（由NTD Patent & Trademark Agency Ltd.代理）。基于疏水修饰联合氨基酸修饰为主要特征的第三代高亲和修饰技术中，适配子上的候选修饰位点及修饰分子类型种类繁多，人工合成所有的化学修饰适配子并进行验证显然费时费力。目前，公司正利用自己建立的DNA芯片技术快速高通量获取化学修饰适配子与靶蛋白结合能力的数据，构建并训练人工智能生成预测模型，从而加快开发第四代高亲和性修饰策略的研发进程（图12）。

Reference

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Florio, M., K. Gunasekaran, M. Stolina, X. Li, L. Liu, B. Tipton, H. Salimi-Moosavi, F. J. Asuncion, C. Li, B. Sun, H. L. Tan, L. Zhang, C. Y. Han, R. Case, A. N. Duguay, M. Grisanti, J. Stevens, J. K. Pretorius, E. Pacheco, H. Jones, Q. Chen, B. D. Soriano, J. Wen, B. Heron, F. W. Jacobsen, E. Brisan, W. G. Richards, H. Z. Ke & M. S. Ominsky. (2016). A bispecific antibody targeting sclerostin and DKK-1 promotes bone mass accrual and fracture repair. Nat Commun 7: 11505.